Здесь угодник Божий начал иноческое подвижничество, отличаясь глубоким смирением.
О его строгой иноческой жизни стало известно в монашеской среде.
Через три года после вступления в Золотниковскую обитель братия соседнего Яхромского Космина монастыря, не имевшего в ту пору настоятеля, стали просить местное духовное начальство о доставлении им в игумены Митрофана. Просьба была исполнена.
Вначале подвижник был рукоположен в иерейский сан, затем, несмотря на нежелание, был возведен в игумены Яхромской обители.

Когда о ревности подвижника узнал Патриарх Московский и всея Руси Иоаким, он поручил ему более обширную Унженскую обитель, основанную в XV в. преподобным Макарием Желтоводским в Костромской земле.
Здесь будущий святитель настоятельствовал около семи лет, в течение которых монастырь достиг процветания.
Был построен храм в честь Благовещения Пресвятой Девы Марии, написано немало замечательных икон.

Монастырь игумена Митрофана привлекал внимание не одного Патриарха, но и царя Феодора Алексеевича, который посещал обитель и нередко беседовал с настоятелем. При дворе к святому относились с особым почтением.
Когда в 1682 г., по решению Московского Церковного Собора 1681 г., была образована новая Воронежская епархия, царь Феодор первым её епископом предложил назначить игумена Митрофана. Епископскую хиротонию 2 апреля 1682 г. возглавил Патриарх Иоаким.

Святителю Митрофану пришлось быть свидетелем бунта раскольников в июле того же года и присутствовать на «прении о вере» между старообрядцами и православными в Грановитой палате.
Это событие произвело на него сильное впечатление и впоследствии сказалось на его архиерейских делах.
Свт. Митрофан приобрел известность как обличитель раскола и сподвижник начинаний царя-реформатора.
Свт. Митрофан рассматривал духовенство как силу, способную воздействовать на население самым благотворным образом.
В самом начале своей деятельности святитель начал сооружать в Воронеже новый каменный храм в честь Благовещения Пресвятой Богородицы.
Свт. Митрофан любил церковное благолепие и вкладывал в строительство собора огромные средства.
Быт святителя был более чем скромен.

Особую страницу в биографии свт. Митрофана составляют его взаимоотношения с Петром I.
Святитель глубоко и сочувственно входил в судьбу молодого царя, старался содействовать возникавшим полезным для Отечества преобразованиям.
Он одобрял постройку флота, предпринятую Петром I в Воронеже, и поддержал её материально.
Когда в 1696 г. русские войска одержали победу над турками под Азовом, Петр I повелел свт. Митрофану как бы в награду за участие в этой победе именоваться епископом Воронежским и «Азовским».

В то же время святитель Митрофан не мог одобрить слишком тесного общения царя с иноземными иноверцами и бездумного восприятия их обычаев.
Святитель отказался посетить воронежский дворец царя из-за находившихся в нем языческих статуй.
Когда разгневанный Петр стал грозить ему смертью, святитель начал готовиться к ней, предпочитая умереть, нежели одобрить неприемлемые для православного человека языческие ритуалы.

Исповедничество епископа устыдило Петра, в знак согласия с ним он убрал статуи, и мир был восстановлен.
На Воронежской кафедре угодник Божий пробыл 20 лет, до самой своей кончины.
Любимым размышлением святого было памятование о смерти, о загробной жизни, о мытарствах; любимой молитвой — молитва об умерших.

Не будучи знаком с распространенной в XVII в. латинской схоластикой, святитель Митрофан прекрасно знал Священное Писание и святоотеческие труды.
В своем «Духовном завещании» свт. Митрофан назидал:
«Для всякого человека таково правило мудрых мужей: употреби труд, храни умеренность — богат будешь; воздержно пей, мало ешь — здрав будешь; твори благо, бегай злого — спасен будешь».

Преставился к Богу святитель Митрофан в 1703 г. в глубокой старости.
Незадолго до кончины святитель принял схиму с именем Макарий.
Погребён он был в Благовещенском соборе в Воронеже с большими почестями: царь своими руками помогал нести гроб святителя, почитаемого им за «святого старца».
С 1820 г. число почитателей молитвенной памяти святителя Митрофана особенно возросло, при соборе начали появляться записи о чудесах на его гробнице.

В 1831 г. последовало официальное донесение об этом Синоду, по решению которого 7 августа 1832 г. состоялось торжественное открытие гроба, а затем последовала канонизация святителя.
От его святых мощей по милости Божией происходили многочисленные исцеления страждущих телесными и душевными недугами, одержимых, расслабленных.

В 1836 г. при Благовещенском соборе в Воронеже был учрежден Благовещенский Митрофанов монастырь.

3 февраля 1919 г. в Митрофановском монастыре особая комиссия, составленная из представителей губисполкома, горисполкома, представителей съезда (по два от каждого уезда), городского отдела здравоохранения, редакции «Известий» и других учреждений, под председательством секретаря губернской чрезвычайной комиссии Бессмертного, произвела вскрытие раки Митрофана Воронежского.

Согласно заключению комиссии, что мощи состояли из рассыпающегося черепа с приделанными к нему чужими волосами, нескольких костей другого происхождения, а основную массу составляли покрывала и тряпичная кукла, набитая истлевшим материалом.
При вскрытии мощей присутствовал и подписал акт вскрытия архиепископ Воронежский и Задонский Тихон (Никаноров).
Мощи были подняты на штыки для показа присутствующим, затем стали экспонатом антирелигиозного музея, расположившегося в Покровском храме.

В 1964 г. епископ Владимир (Котляров, тогда Воронежский, позже митр. Петербургский) тайно получил мощи, которые 25 лет находились в архиерейском доме.

В 1989 г. открыты для поклонения в возвращённом Покровском соборе.

В 1988 (2000-летие Р.Х.) принято решение в память о трёх главных храмах Воронежа (Благовещенский, Троицкий и Владимирский) воссоздать Благовещенский собор (1682) в Первомайском саду.

Туда в 2009 г. перенесены мощи Свт. Митрофана.