С 1770 года святитель исполнял разные послушания при Черниговском кафедральном соборе и Свято-Троицком монастыре.

В 1776 году началось его служение в России: игуменом Новгородского Кириллова монастыря, наместником Александро-Невской Лавры, в Новгородском Отенском монастыре, в Вяжицком (возведён в сан архимандрита), Новгородского Юрьева монастыря.
В 1788 году хиротонисан во епископа Старорусского, викария Новгородской епархии.
С 1795 года владыка Афанасий – епископ Могилёвский и Полоцкий.
11 мая 1797 года награжден орденом св. Александра Невского.

«Но, – как сказано в житии, – эта звезда была уже последнею на жизненном небосклоне Святителя Божия и, как эмблема земного величия и славы, скоро померкла».
В том же году «Один недостойный диакон, некий Харкевич, забыв наставление Слова Божия, по которому не подобает диакону быти двоязычну, подобно Иуде Искариотскому, продавшему своего Учителя и Господа за 30 сребреников, продал своего архипастыря Афанасия духу злобы и лукавства, духу гордости и честолюбия: он оклеветал его ужасною клеветою. Посланный в Св. Синод донос взводил на Святителя Божия тяжкие преступления в нравственном и даже гражданском отношениях. Святитель Афанасий обвинялся, страшно вымолвить, «в прелюбодеянии, лихоимстве, несоблюдении табельных дней и в других не менее тяжких преступлениях». Был верный расчет доносчика обвинять епископа, как монаха, — в прелюбодеянии, как начальника, — в лихоимстве, как подданного, — в несоблюдении табельных дней, потому что в этих пороках могло сказаться всё худое о ненавистном диакону его архипастыре».

Узнав о содержании доноса, Преосвященный Афанасий обратился с прошением об увольнении его от управления епархией, имея в виду также оградить Православие в крае от поношений и подозрений.
Указом Императора, в удовлетворение прошения, епископ Афанасий (Вольховский) был удалён с кафедры и определён на покой в Мгарский Спасо-Преображенский монастырь Полтавской губернии.
О несправедливом характере обвинений в адрес святителя свидетельствует тот факт, что по делу о столь тяжких клеветах не было назначено никакого следствия, а самому епископу Императорским указом была назначена пенсия.

Через полгода святитель прибыл в Полтаву к родным и опочил у них на руках 1 января 1801 г.
В 1882 году Преосвященный Иларион, обозревая гробницу Преосвященного Афанасия в Полтаве, обнаружил нетление тела его. О сем было донесено в Синод, откуда последовало предписание изнести гроб из усыпальницы, а в склепе устроить церковь, где поставить мощи и там служить панихиды до времени официальной канонизации.

Ввиду многих исцелений и чудес материалы к канонизации святителя Афанасия были подготовлены в самое краткое время. Имя святителя Афанасия было внесено в готовящийся к изданию Полтавский патерик. Торжества по случаю прославления святителя Афанасия планировалось совершить после Собора Русской Церкви 1917 года, однако сему воспрепятствовала начавшаяся революция.

Погребённые под полом Крестовоздвиженского собора Полтавского монастыря мощи были переданны в краеведческий музей как экспонат музея атеизма, а во время немецкой оккупации возвращены монастырской общине и вновь погребены под полом Крестовоздвиженского собора.
Имеются многочисленные свидетельства о силе молитвенного предстательства блаженной памяти епископа Афанасия. В книге, изданной более 100 лет назад, высказано твёрдое убеждение: «Жизнь этого Святителя разрешилась скорбями, вследствие перенесенных им людских напастей и клеветы человеческой, и, вероятно, поэтому он, будучи сам искушён клеветою, может и другим, сущим в скорбях от клеветы и напраслины, помогать данною ему от Бога благодатью».

27 мая 2010 г. Украинская Православная Церковь причислила к лику местнопочитаемых святых архиепископа Афанасия Полтавского (Мгарского), а 2 июня были обретены его нетленные мощи, которые ныне почивают в усыпальнице Крестовоздвиженского женского монастыря г. Полтава.